Q＆A

Q-1 血清为什么比原来贵？

A-1  a. 市场需求持续增加（生物产业发展迅猛）

细胞治疗、单抗生产、抗体药生产、疫苗生产等

b. 血源有限

2013年下半年，南美血清开始紧张，

2014年8月底，澳洲血清禁止出口；即便不禁止，血清供应也是紧张的，牛对环境污染是很严重的，在澳洲牛的数量是受到严格限制的；

C. 国内：牛肉及其牛相关食品的市场要进大于血清市场。随着国外疫情蔓延，可进口的牛肉越来越少，所以对国内牛肉的需求比以前大大增加，价格也上涨很多，即成牛的需求增加。血清采集的成本随之增加。

Q-2 如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损?

A-2 建议血清应保存在-2O℃。若一次无法用完一瓶，无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

将血清从冷冻箱取出后，置于2～8℃冰箱缓慢融解，一般是融解过夜。

Q-3 血清中包含絮状沉淀，它们是什么，怎么处理?

A-3  沉淀主要成分是纤维蛋白和脂蛋白，不会影响血清品质，但必须去除，因为沉淀会影响细胞与细胞之间的联系，诱导细胞聚集，影响细胞贴壁等。

首先让其沉淀在瓶子底部，中上层无沉淀血清直接使用；下层血清装到50ml无菌离心管，400g，离心3分钟即可除去(一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤)。

Q-4 实验室如何选择适合的血清?

A-4  稀有的澳洲血清培养娇贵细胞（小鼠ES、原代细胞分离培养）；南美血清或国产胎牛血清用于癌细胞、常见细胞系培养；新生牛血清用于病毒包装（构建稳转细胞株）。

Q-5 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗?

A-5您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素，应该在2周内使用。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

Q-6 有必要做热灭活吗?

A-6 实验证实，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而且经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物增更多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

若非必须，无需热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!

Q-7 细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理?

A-7 您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培养基是否混浊，然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。

如果在镜下观察细胞，生长状态良好，不黑点出现前相比，没有任何变化，那么，黑点的出现可能不以下几种情况有关：

a、细胞生长过老，破碎的细胞残骸;

b、血清质量不好，反复冻融的结果;

c、配制培养基的pH值偏高，不宜细胞生长;

d、培养原代细胞中出现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除。

Q-8 培养细胞不贴壁？怎么办？

A-8

可能原因	解决办法
胰蛋白酶消化过度	缩短消化时间或降低胰蛋白酶浓度
支原体污染	如发现支原体污染，及时丢弃培养物。
细胞老化（如传代前细胞已汇合导致失去贴附性）	复苏新的保种细胞
消化液戒培养液配制错误、过期储存、储存不当	重新配置消化液或培养液
接种细胞起始浓度太低或太高	调节最佳接种细胞浓度

名称	货号	适应类型
胎牛血清（澳洲）	XQ-2001	部分干细胞、原代细胞等娇贵细胞及肿瘤细胞、常见细胞系
胎牛血清（南美）	XQ-2010	部分原代细胞及肿瘤细胞、常见细胞系
胎牛血清（标准级）	XQ-1010	肿瘤细胞、部分细胞系、293细胞
新生牛血清	XQ-1002 XQ-1001	部分肿瘤细胞、293细胞

     我国的试剂规格基本上按纯度（杂质含量的多少）划分，共有高纯、光谱纯、基准、分光纯、优级纯、分析和化学纯等7种。

 

     国家和主管部门颁布质量指标的主要优级纯、分级纯和化学纯3种。
（1）优级纯（GR：Guaranteed reagent），又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度最高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。
（2）分析纯（AR），又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。
（3）化学纯（CP），又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于工矿、学校一般分析工作。使用蓝色（深蓝色）标签。
（4）实验试剂（LR：Laboratory reagent），又称四级试剂。

     除了上述四个级别外，目前市场上尚有：
基准试剂（PT：Primary Reagent）：专门作为基准物用，可直接配制标准溶液。

光谱纯试剂（SP：Spectrum pure）：表示光谱纯净。但由于有机物在光谱上显示不出，所以有时主成分不到99.9%以上，使用时必须注意，特别是作基准物时，必须进行标定。

     高纯试剂:纯度远高于优级纯的试剂 高纯试剂通常应用于（≥ 99.99%），例如针对色谱使用的色谱纯试剂、针对光谱使用的光谱纯试剂。不同行业使用的高纯试剂有各自的标注方式 ，纯度表示:通用的标注是用9的数目来表示。例如，纯度为99.999%，含五个九则表示为5N；纯度为99.995%，含四个九一个五，表示为4.5N。

     目前，国外试剂厂生产的化学试剂的规格趋向于按用途划分，常见的如下：
生化试剂 （BC：Biochemical）
生物试剂 （BR：Biological reagent）
生物染色剂 （BS：Biological Stain）
络合滴定用 （FCM：For Complexometry）

色谱分析（FCP：For chromatography purpose）
荧光分析（FIA）
微生物用（FMB）
显微镜用 （FMP：For microscopic purpose）
合成用（FS：For synthesis）
气相色谱（GC：Gas chromatography）
高压液相色谱 （HPLC：High Pressure Liquid chromatography）
指示剂（Ind：Indicator）
红外吸收（IR）
液相色谱（LC）
核磁共振（NMR）
有机分析标准（OSA：Organic analytical standard）
分析用（PA：Pro analysis）
实习用 （Pract： Practical use）
Puriss （Purissmum 特纯）
合成（SYN）
工业用(Tech:Techincal grade）
薄层色谱（TLC：Thin Layer chromatography）
分光纯、光学纯、紫析分光光度纯（UV：Ultra violet pure）

       高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。

454公司首选将焦磷酸测序应用在测序技术上，之后便被罗氏诊断收购，形成了目前的Roche 454。待测DNA样品被打断成300-800bp的片段后，3' 和5'端分别加上接头，这些接头会使DNA片段结合到微珠上。测序PCR反应就发生在固相的微珠上，并且整个PCR反应和相关的酶被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包含1个DNA模板。扩增后，每个DNA分子可以得到富集，每个微珠只能形成一个克隆集落。454测序仪的测序通道体积非常狭小，只能容纳一个微珠。测序过程中，GS FLX系统会将引物上dNTP的聚合与荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号，就可以达到DNA测序的目的。相对于Sanger测序，Solexa和Solid测序而言，454可以提供中等的读长和适中的价格，适合de novo 测序、转录组测序、宏基因组研究等。

Solexa的测序原理是可逆终止化学反应。DNA片段加上接头之后，可以随机的附着于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面经过桥式扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇，被用做测序模板。测序采取边合成边测序的方法，和模板配对的ddNTP原料被添加上去，不配对的ddNTP原料被洗去，成像系统能够捕捉荧光标记的核苷酸。随着DNA 3'端的阻断剂的去除，下一轮的延伸就可以进行。和焦磷酸测序不同，每次DNA的只能延伸一个核苷酸。Solexa的读长在100-150bp之间，适合小RNA鉴定、甲基化和表观遗传学研究。

ABI Solid技术的核心是4种荧光标记寡核苷酸的连接反应测序。测序之前，DNA模板通过乳化PCR扩增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3'端修饰的微珠可以沉淀在玻片上。连接测序所用的底物是8个碱基荧光探针混合物，根据序列的位置，样品DNA就可以被探针标记。DNA连接酶优先连接和模板配对的探针，并引发该位点的荧光信号的产生。Solid的读长只有50-75bp，精确度可达Q40，适于基因组重测序和SNP检测。

三个厂家的高通量测序仪器虽然各具特点，在原理上很多的共同之处：

1 将目标DNA剪切为小片段

2 单个小片段DNA分子结合到固相表面

3 单分子独立扩增

4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号

5 高分辨率的成像系统

高通量测序以其高输出量与高解析度的特性，不仅为我们提供了丰富的遗传学信息，而且使得测序的费用和时间大大缩短。在高通量测序发展的过程中，也有很多的问题需要我们去解决：数据在临床诊断上的作用，测序数据的储存和分析，数据的安全和信息隐私等。

摩尔

     科学上把含有阿伏伽德罗常数（约6.02×10^23)个微粒的集体作为一个单位，叫摩尔 。摩尔是表示物质的量（符号是n）的单位，简称为摩，单位符号是mol。 物质的量是物理量，表示含有一定数目粒子的集合体，符号为n。物质的量的单位为摩尔。1mol不同物质中所含的粒子数是相同的，但由于不同粒子的质量不同，1mol不同物质的质量也不同。

摩尔浓度计算

溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为:

质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)

稀释计算

配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：

开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积

稀释公式

稀释公式一般简略地表示为: C1V1 = C2V2 

MSDS / COA批次特异的分子量。

蒸馏水：就是将水蒸馏、冷凝的水，蒸二次的叫重蒸水，三次的叫三蒸水。水中可能含有与沸点相接近的物质，蒸馏法很难清除。

去离子水：经过阴、阳离子交换柱以后的水，杂质阴、阳离子均已除去，故称为去离子水.去离子水除掉的是离子化合物，没有离子化的有机物或微生物则不能被清除。

高纯水：是高纯度水的统称了，不管你是蒸馏水，或离子交换，或EDI（Electrodeionization）连续电除盐技术，或电渗透，或反渗透，或膜分离或其组合工艺等各种工艺制得高纯度水，都可称为高纯水。
也有的说高纯水专门是指经过混床处理的除盐水，其纯度要高于蒸馏水，高纯水电导率<0.2，而蒸馏水电导率<2.0(μc/cm2)。

超纯水：水的电导率达到18MΩ/cm3的水，则称为超纯水。通过数次高性能的离子交换树脂处理后再经过微孔滤膜过滤，所得到水的电导率可达18MΩ/cm3，接近理论纯水的18.3MΩ/cm3，即为超纯水。可以通过超纯水器制备。超纯水既无离子也无微生物，可用于分子克隆，dna测序，细胞培养等各种精细试验。

试验用水可分为去离子水，蒸馏水（双蒸水）、超纯水三个级别，一般的试验器皿器具的洗净用去离子水即可，一般试剂配置可用双蒸馏水，而重要的精细试验应用超纯水。

编号	P00001	P00036	P00002	P00035	P00003	P00004	P00037	P00039
名称	Western及IP细胞裂解液	RIPA裂解液(高)	RIPA裂解液(中)	RIPA裂解液(低)	NP-40裂解液	SDS裂解液	Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)	RIPA裂解液(强，无抑制剂)
组分	1% Triton X-100	1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS	1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS	1% NP-40, 0.25% deoxycholate	1% NP-40	1% SDS	1% Triton X-100	1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS
裂解强度	温和	强	中	温和	温和	强	温和	强
膜蛋白	一般	很好	较好	一般	一般	很好	一般	很好
胞浆蛋白	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好
核蛋白	较好	很好	较好	较好	较好	很好	较好	很好
胞浆磷酸化蛋白	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好
细胞核转录因子	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好	很好
含蛋白酶抑制剂	是	是	是	是	是	是	否	否
含磷酸酯酶抑制剂	是	是	是	是	是	是	否	否
主要用途	WB, IP,co-IP	WB, IP	WB, IP	WB, IP, co-IP	WB, IP,co-IP	WB, ChIP	WB, IP,co-IP	WB, IP