尊敬的客户,感谢您选用本公司的产品。使用前请仔细阅读说明书.

仅供科研使用，不适用于临床诊断。

简介：

Paragen RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组 DNA 进行 Real Time RT PCR 反应的专用反转录试剂。 Kit 中使用了具有较强 DNA 分解活性的 gDNA Eraser ，通过 42℃，2 min 即可除去基因组 DNA 。同时由于反转录试剂中含有抑制 DNA 分解酶活性的组分，经过 gDNA Eraser 处理后的样品可以直接进行 15 min 的反转录反应合成 cDNA ，因此 20 min 内即可迅速完成从基因组 DNA 去除到 cDNA 合成的全过程。使用本制品合成的cDNA 适用于染料法和探针法qPCR 分析。

制品内容：

*1：5×gDNA Eraser Buffer 在反转录反应前使用，请务必进行基因组 DNA 的除去反应。

*2：含有 RNase Inhibitor 。

*3：含有 dNTP Mixture 。

*4：含有 Oligo dT Primer 和 Random 6 mers 。

*5：制作标准曲线时梯度稀释 cDNA 或 RNA 标准品的稀释液。

保 存： -20℃。

操作步骤：

1. 去除基因组 DNA 反应

按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数＋2 的量配制 Master Mix ，然后再分装到每个反应管中 ，最后加入 RNA 样 品 。

42℃，2 min （或者室温 5 min ^*2）；4℃保存。

*1：20 μl反转录反应体系中， 染料法最多可使用 1 μg 的 Total RNA 探针法 最多可使用 2 μg的 Total RNA 。

*2：室温反应时，可以延长至 30 分钟。

2. 反转录反应

反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数＋2 的量配制 Master Mix ，然后再分装 10 μl到每个反应管中 ^*3 。 轻柔混匀后立即进行反转录反应。

【 染料分析法 】

1. 按下列组份配制 RT 反应液（反应液配制请在冰上进行）。 为了保证反应液配制的准确性减少分装时造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入 RNA 样品。

Master Mix（10 μl）反应液的配制：

2. 轻柔混匀后进行反转录，反应条件：37℃孵育15 min 进行反转录反应，85℃下5 sec 使反转录酶失活，4℃保存^*6。

【 探针分析法 】

2. 轻柔混匀后进行反转录，反应条件：37℃孵育15 min 进行反转录反应，85℃下5 sec 使反转录酶失活，4℃保存^*6。

*3：若不配制Master Mix，向步骤1的反应液中添加试剂时，要先加入RNase Free dH₂O和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)混合均匀，以使gDNA Eraser的活性充分受到抑制，再添加RT Primer Mix、PrimeScriptRT Enzyme Mix I，轻轻混匀进行反转录反应。

*4：使用RT Primer Mix可以高效合成cDNA。

*5：反转录体系可以根据需要相应扩大。

*6：合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。

注意：1) 在反转录反应中，染料法的RT Primer Mix 用量为1 μl，探针qPCR分析法的用量为4 μl。

2) 得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。